J9九游国际医药依托拥有实验动物使用许可证的实验动物中心进行合作，为您提供主要包括模型制备、受试物给药、标本采集、功能指标检测等技术服务。

服务目录号：#OGF-002

服务项目：有助于抗氧化

服务内容：

1.选用10 月龄以上老龄大鼠或 8 月龄以上老龄小鼠，也可用氧化损伤模型鼠。

2.推荐用单一性别，小鼠每组10－15 只，大鼠 8－12 只。

3.实验设三个剂量组和一个溶剂对照组，以人体推荐量的10 倍（小鼠）或 5 倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，高剂量一般不超过 30 倍，必要时设阳性对照组、空白对照组。受试样品给予时间30 天，必要时可延长至 45 天。

4.器/体重比值测定：胸腺/体重比值，脾脏/体重比值。

5.结果判定：3 个剂量组给予不同浓度受试样品，对照组给予同体积溶剂，实验结束时处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原型谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

客户提供：受试样品、阳性对照品

J9九游国际提交：详细研究报告

服务周期：3个月

服务目录号：#OGF-002-1

模型名称：D －半乳糖氧化损伤模型

D-半乳糖供给过量，超常产生活性氧，打破了受控于遗传模式的活性氧产生与消除的平衡状态，引起过氧化效应。选 25－30g 健康成年小鼠，除空白对照组外，其余动物用 D-半乳糖 40mg－1.2g/kg BW 颈背部皮下注射或腹腔注射造模，注射量为 0.1mL/10g，每日 1 次，连续造模 6 周，取血测 MDA，按 MDA 水平分组。随机分为 1 个模型对照组和 3 个受试样品剂量组，3 个剂量组经口给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，在给受试样品的同时，模型对照组和各剂量组继续给予相同剂量 D-半乳糖颈背部皮下或腹腔注射，实验结束处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原型谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

服务目录号：#OGF-002-2

模型名称：乙醇氧化损伤模型

乙醇大量摄入，激活氧分子产生自由基，导致组织细胞过氧化效应及体内还原型谷胱甘肽的耗竭。选25－30g 健康成年小鼠（180－220g 大鼠），随机分为 4 个组，1 个模型对照组和 3 个受试样品剂量组，必要时可增设 1 个空白对照组。3 个剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，连续灌胃

30 天，末次灌胃后，模型组对照组和 3 个剂量组禁食 16 小时（过夜），然后 1 次性灌胃给予 50%乙醇 12mL/kgBW，6 小时后取材（空白对照组不作处理，不禁食取材），测血清或肝组织脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原型谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

服务目录号：#OGF-002-3

模型名称：脂质氧化产物测定

血中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量可采用荧光法和比色法测定，方法任选其一。

将10nmol/mL 四乙氧基丙烷，用双蒸水稀释成 0.0、0.25、0.5、1.0、1.5、2、3、5、10nmol/mL 分别取0.1mL 加入酸水解液 2mL、TBA 工作液 0.5mL→混匀，避光、沸水浴 60min→流水冷却至室温→3mL 正丁醇振荡抽提 1min→3000r/min 离心 5min→取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝 1.5nm，出射狭缝 5nm，

激发波长536nm，发射波长 550nm）以四乙氧基丙烷浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。

服务目录号：#OGF-002-4

模型名称：比色法

MDA（malondiadehycle）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1 个丙二醛（MDA）分子与 2 个硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。该物质在波长 532nm 有极大吸收峰。可用分光光度法进行测定。组织匀浆样品：取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，置匀浆器中，加入 0.2M 磷酸盐缓冲液，以 20000r/min 匀浆 10s，间歇 30s，反复进行 3 次，制成 10%组织匀浆（W/V），3000r/min 离心5－10min，取上清液待测。

服务目录号：#OGF-002-5

模型名称：蛋白质氧化产物测定

H 2 O 2 或 O 2 ·ˉ自由基对蛋白质氨基酸侧链的氧化可导致羰基产物的积累。羟自由基也可直接作用于肽链，使肽链断裂，引起蛋白质一级结构的破坏，在断裂处产生羰基。羰基化蛋白极易相互交联、聚集为大分子从而降低或失去原有蛋白质的功能，蛋白质羰基含量可直接反映蛋白质损伤的程度。蛋白质羰基形成是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志，它随着年龄的增长而增加。

取0.1g 组织，在冰的生理盐水中漂洗，以去掉表面的血迹。加入 0.9mL 的冰的 10 mmol/L HEPES 缓冲液（pH7.4），制成 10%的匀浆。将匀浆液以 3000r/min 的转速，离心 10 min，保留上清。取 100g/L 的硫酸链霉素溶液 50µL，加入上清液 450µL（v/v,1:9），室温放置 10 min 后，以 11000r/min 的转速，离心 10 min，取上清液待测。

服务目录号：#OGF-002-6

模型名称：抗氧化酶活力测定

SOD 催化超氧阴离子自由基（O 2 ·ˉ）生成 H 2 O 2 ，再由其它抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶作用生成水，这样可以清除 O 2 ·ˉ对细胞的毒害作用。SOD、GSH-Px 在动物某些器官和人体血红细胞中的含量均有明显的增龄变化，酶活性与生物年龄的增长成反比。消除自由基的能力与酶活性成正比。1.3.6.1 血或组织中超氧化物歧化酶（SOD）活力测定。

溶血液：取鼠血10μL 加入到 1mL 双蒸水中，充分振摇，使之全部溶血 1:100 待测，4h 内测定酶活力。若当天来不及测定，将肝素抗凝全血置-20℃冻存，3d 内测定，若 4℃存放，28h 内必须测完。测前取出样品室温自然解冻。

组织上清液：动物禁食过夜，处死后，立即取出所需脏器，放入冷生理盐水中洗去浮血，剔除脂肪及结缔组织，滤纸吸干后，在冰浴上剪成碎块，称取适量组织，加冷0.2M 磷酸缓冲液，以 20000r/min 匀浆 10s，间歇 30s，反复 3 次制成 5%组织匀浆，操作在冰浴中进行，匀浆以 12500×g 离心 10min（低温高速离心机），

以沉淀为破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体，上清液用以测胞液中的酶活力，最好当天测，否则加20%（v/v）甘油分装于塑料管，放置-20－-80℃，可保存数周，而酶活力不减。1.3.6.2.3.2 GSH 标准曲线的制作：取 1.0mmol/LGSH 溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于 10mL 小容器瓶中，各加入偏磷酸沉淀剂 8mL，用双蒸水稀释至 10mL 刻度，即得到浓度为 0、20、40、60、80、100μmol/L 的 GSH 标准液。取上述不同浓度标准液各 2mL，放入试管中，加入 0.32mol/L Na 2 HPO 4 2.5mL，比色前加入 DTNB 显色液 0.5mL 用光径 1cm 杯，5min 内在可见光 423nm 波长测 OD 值，以双蒸水调零点。以 GSH 含量（μmol/L）为横坐标，OD 423 值为纵坐标，绘制标准曲线。

服务目录号：#OGF-002-8

模型名称：抗氧化物质还原型谷胱甘肽（GSH）

谷胱甘肽是一种低分子清除剂，它可清除O 2 - 、H 2 O 2 、LOOH。谷胱甘肽是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种三肽，是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物，是 GSH-Px 和 GST 两种酶类的底物，为这两种酶分解氢过氧化物所必需，它能稳定含巯基的酶，和防止血红蛋白及其它辅助因子受氧化损伤，缺乏或耗竭 GSH会促使许多化学物质或环境因素产生中毒作用，GSH 量的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。

溶血液上清液：取0.1mL 抗凝全血加双蒸水 0.9mL（1：9 溶血液），充分混匀，直至透亮为止。取溶血液 0.5mL 加 4%磺基水杨酸 0.5mL 混匀，室温下 3500rpm 离心 10 分钟，取上清液备用。血清上清液：取 0.1mL 血清加 4%磺基水杨酸 0.1mL 混匀，室温下 3500rpm 离心 10 分钟，取上清液备用。组织上清液：取组织 0.5g 加生理盐水 4.5mL 充分研磨成细浆（10%肝匀浆），混匀后取浆液 0.5mL 加 4%磺基水杨酸 0.5mL 混匀，室温下 3500rpm 离心 10 分钟，取上清液备用。

服务目录号：#OGF-002-9

模型名称：血中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px ）活力测定

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化 GSH 氧化的反应速度，及单位时间内 GSH 减少的量来表示，GSH 和 5，5’-二硫对硝基苯甲酸（DTNB）反应在 GSH-Px 催化下可生成黄色的 5-硫代 2-硝基苯甲酸阴离子，于 423nm 波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出 GSH 减少的量，由于 GSH 能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的 GSH 减少。

溶血液：取血20μL 加入到 1mL 双蒸水中，充分振摇，使之全部溶血 1:100 待测，4 小时内测定酶活力。若当天来不及测定，将肝素抗凝全血置-20℃冻存，3 天内测定，若 4℃存放，28 小时内必须测完。测前取出

样品室温自然解冻。